免疫-質量分析法（Immuno-MS）による血清AFPの定量分析
Immuno-MSは、免疫沈降法 (Immunoprecipitation, IP) と質量分析 (Mass spectrometry, MS) を組み合わせた手法であり、IP-MSとも呼ばれています。分析対象タンパク質（抗原）を抗体との反応性を利用して精製するため（アフィニティ精製）、生体試料に含まれる微量タンパク質の分析に威力を発揮します。当社では、肝臓癌の血清マーカーの一つであるα-fetoprotein (AFP) を対象にしてImmuno-MSによる定量分析の手順を整備しました。多摩川精機株式会社との共同研究です（Takahataら、2023年; PMID: 37260735）。整備した技術は受託分析などを通じて、ご活用いただく予定です。
AFPはこんなタンパク質です。
・胎児の肝細胞や卵黄嚢で産生
・誕生後に血清アルブミンに代替
・分子量約70万
・肝細胞癌や精巣腫瘍の腫瘍マーカー（図1)
・iPS細胞などの分化の状態を示すマーカーとしても広く利用されています。
図1．肝癌マーカー、α-fetoprotein (AFP)
定量分析系の構築にあたって、抗AFP抗体を磁性粒子に固定化しました（図2）。
図2．抗AFP抗体の固定化
固定化反応はリンカー分子による共有結合を介しておこないました。この固定化の様式は、Protein A/Gを用いた方法に比べて抗原と抗体を分離しやすい点で有利です。
固定化抗体を用いて、血清にAFPの組み換え体を一定量添加したモデル試料からAFPをアフィニティ精製しました。抗体固定化のための磁性粒子を多摩川精機のFG beads®と他社製品との間で比較したところ、FG beadsの方が非特異的な結合が少ないことが分かりました（図3）。
図3．アフィニティ精製試料のSDS-PAGE
磁性粒子に固定化した抗AFP抗体を用いてImmuno-MSの工程を整備しました（図4）。
図4．Immuno-MSの工程
本工程では、血清からアフィニティ精製したAFPを固定化抗体から分離回収したあとに、トリプシンによる加水分解に供しました。LC-MS/MSによるAFP由来ペプチドの定量測定は、既知量を添加した安定同位体標識ペプチドの検出強度を指標にしました。
一般にImmuno-MSは、微量の抗原分子から当該分子由来のペプチド断片を特異的かつ効率的に回収することが重要です。ペプチド回収までの工程は、抗原タンパク質を固定化抗体に結合したまま加水分解する方法と、加水分解の前に抗原を固定化抗体から溶出、回収する手順（溶出後加水分解）に大別されます。本研究では後者の条件を最適化しました。抗体をあらかじめ磁性粒子に共有結合しているので抗原と抗体の分離が容易であり、このため抗体由来の分解ペプチドの混入を低減することができます。
分析手順の最適化にあたっては、抗原AFPの溶出液の組成を比較検討しました。その結果、0.1％TFAで酸性にした50％アセトニトリル水溶液で溶出した場合にAFPの回収率が最も高く（図5）、かつ固定化抗体に結合したまま加水分解するよりも高い計量値が得られました。
図5. 溶出液の組成の最適化
AFP由来ペプチド断片のひとつ、TFQAITVTKの測定結果を示しました。
血清に添加したAFP標品を、固定化抗体を用いて精製。その後、溶出液
中に回収したAFPをトリプシン加水分解に供しました。各条件ともに3複製。
(A) ペプチドの計量値（検出強度）
◇： 抗原AFP由来
◆： 既知量添加した安定同位体標識体
(B）標識体の検出強度を指標に算出したAFP濃度
この溶出液を用いて定量性を検討したところ、添加したAFP標品の濃度範囲0～100 ng/mLにおいて高い検出直線性を示しました（R2 > 0.996）（図6）。また、検量線の回帰式を用いて内在性の血清AFPの濃度を算出したところ、2.3～2.4 ng/mLの値が得られました。この定量値は、既報の標準ヒト血清中の濃度範囲（10 ng/mL未満）にも整合しています。
図6．定量性の評価
AFP由来ペプチド断片のうち、TFQAITVTK (A)およびYIQESQALAK (B)
を評価の対象としました。
Immuno-MSでは、交差反応性を持つ抗原をMSで区別することが可能です。このため、翻訳後修飾の分析やアイソフォームの個別定量にも適しています。
今後は、本研究で構築した定量分析手順を他のマーカータンパク質に適用し、手順の有用性を確かめる予定です。また、磁性粒子の特性を生かした分析工程の自動化や多試料の同時調製も検討していきます。
2018年4月9日掲載
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